محیط کشت آگار آگار چیست؟ + آگار در محیط کشت
آگار، یا آگارآگار، به طور گسترده به عنوان محیط کشت برای رشد ریزاندامگان استفاده می‌شود. خود این ماده نیز محصول ریزاندامگان است.
حل شدن و سرد شدن
آگار-آگار در زبان مالایی به معنای ژله است. این ماده سفید رنگ، بدون طعم و بو است که از دیواره سلولی برخی جلبک‌های قرمز به دست می‌آید.
اگر آگار را در آب داغ حل کرده و سپس بگذارید سرد شود، به نوعی ژله تبدیل می‌شود. این ماده به عنوان محیط کشت در پتری دیش برای رشد میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌ها و باکتری‌ها استفاده می‌شود.
جهت خرید آگار آگار برای استفاده در محیط کشت با کارشناسان فروش شرکت بهبود شیمی در تماس باشید.
دمای رشد بهینه
آگار بسیار کندتر از ژلاتین معمولی ذوب می‌شود. این بدان معناست که پتری دیش‌ها را می‌توان بدون ذوب شدن آگار تا دمای رشد بهینه برای میکروارگانیسم‌ها گرم کرد. این دما برای اکثر میکروارگانیسم‌ها حدود 37 درجه سانتیگراد است، یعنی همان دمای بدن انسان.
بستن و ملین
آگار علاوه بر استفاده به عنوان محیط کشت برای میکروارگانیسم‌ها کاربردهای دیگری نیز دارد. به عنوان مثال، از آن برای غلیظ کردن سوپ، به عنوان ملین و به عنوان یک ماده غذایی، به عنوان مثال در دسر آنمیتسو ژاپنی استفاده می‌شود. آگار حتی شماره E خاص خود را دارد (E406).
جایگزین آگار در محیط کشت
در سال 1986، کاراگینان به عنوان جایگزینی برای آگار عامل ژل کننده در کشت بافت گیاهی استفاده شد. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در تحقیق، رشد بافت‌ها روی این ژل بهتر از زمانی بود که محیط با آگار جامد شد.
در کوبا، مرکز تحقیق و توسعه داروها (CIDEM) استفاده از آلوئه ورا (Aloe barbadensis miller) و آرد ساگو (Maranta arundinacea) را به عنوان پشتیبان جامد در محیط های کشت گیاهان دارویی مورد بررسی قرار داد.
این تحقیق نشان داد که جایگزینی جزئی یا کامل آگار با ژل A. vera یا آرد ساگو امکان پذیر است. علاوه بر این، از این محیط کشت برای تکثیر در شرایط آزمایشگاهی آگراز (Vaccinium meridionale Swartz) استفاده شده است.
در سال ۲۰۱۲، مطالعه‌ای در اتیوپی بر روی کارایی نشاسته انست (بولا) به عنوان یک عامل ژل‌کننده انجام شد که به طور قابل توجهی تعداد جوانه‌ها را بهبود بخشید و حدود ۷۲.۵ درصد در هزینه‌ها صرفه‌جویی کرد.
در مطالعه دیگری، جایگزینی بخشی از آگار با نشاسته رقم دیاکول کاپیرو در تکثیر میکرو علفه لولو سولانوم کیتوئنسه لام انجام شد که نتیجه مثبتی داشت.
چشم‌اندازهای آینده در توسعه این فناوری زیستی به سمت جایگزینی قسمتی یا کامل آگار به عنوان عامل ژل کننده با عوامل ژل‌کننده‌ای است که به طور مؤثرتر، آسان تر قابل استخراج، محلی تهیه شوند و موقتی نباشند. علاوه بر بهبود تولید گیاه در فضاهای کوچک و منابع حاصل برای مقابله با چالش های آینده تکثیر میکروبی بدون خطر آلودگی محصول.
محیط کشت میکروبی آگار
آماده‌سازی محیط کشت میکروبی فرآیند مخلوط کردن مواد مغذی، عوامل برای بافر و حفظ تعادل اسمزی و همچنین بازدارنده‌ها یا شاخص‌های انتخابی برای ایجاد آگار یا گوشتابه (Broth) است که از رشد و تمایز میکروارگانیسم‌ها پشتیبانی می‌کند. آماده‌سازی محیط کشت میکروبی یک کار معمول در پایش منظم فساد و میکروب‌های بیماری‌زا در آزمایش‌های میکروبیولوژیکی است.
انواع محیط کشت میکروبی
محیط کشت میکروبیولوژیکی باید شرایط رشد بهینه را برای همه انواع میکروارگانیسم‌ها یا برای انواع خاص فراهم کند. ترکیب دقیق محیط به گونه‌های کشت شده و هدف کاربرد بستگی دارد.
pH محیط باید با توجه به میکروارگانیسم‌ها تنظیم شود. محیط‌های کشت میکروبیولوژیکی بر اساس چندین پارامتر از جمله ترکیبات شیمیایی، ماهیت فیزیکی و عملکرد آن‌ها طبقه‌بندی می‌شوند.
محیط کشت مولر هینتون آگار
آگار مولر هينتون (MHA) چيست؟
آگار مولر هينتون (MHA) توسط مولر و هينتون در سال 1941 براي جداسازي گونه‌هاي پاتوژن نياسريا (Neisseria) ساخته شد. آگار مولر هينتون يک محيط کشت ميکروبي است که به طور معمول براي تست حساسيت به آنتي‌بيوتيک با استفاده از روش انتشار ديسک کيربي-بائر (Kirby-Bauer) به کار مي‌رود.
استفاده از MHA براي انتشار عوامل ضد ميکروبي آغشته شده روي ديسک کاغذي در ژل آگار طبق استاندارد تاييد شده موسسه استانداردهاي آزمايشگاهي و باليني (CLSI) توصيه مي‌شود.
قطر هاله ايجاد شده براي هر ماده ضد ميکروبي، نتايج مقاومت، حساسيت متوسط و حساسيت را براي ميکروارگانيسم‌هاي پاتوژن تعيين مي‌کند که در موسسه استانداردهاي آزمايشگاهي و باليني (CLSI) فهرست شده است.
آگار مولر هينتون با 5 درصد خون گوسفند و آگار مولر هينتون با هموگلوبين براي تست حساسيت به آنتي‌بيوتيک استرپتوکوکوس پنومونيه (Streptococcus pneumoniae) و هموفيلوس آنفلوآنزا (Haemophilus influenza) توصيه مي‌شود. انتخاب MHA توسط CLSI به چند دليل انجام شده است:
- براي تست حساسيت، قابليت تکرار خوبي را بين هر دسته توليد نشان مي‌دهد.
- حاوي سطوح پاييني از مهارکننده‌هاي سولفوناميد، تري‌متوپريم و تتراسايکلين است.
- از رشد بسياري از عوامل باکتريايي پاتوژن غير سخت‌گير پشتيباني مي‌کند.
- داده‌ها و تجربه‌هاي زيادي در مورد عملکرد آن ثبت شده است.
چرا از آگار مولر هينتون (MHA) براي تست حساسيت به آنتي‌بيوتيک استفاده مي‌شود؟
- محیط کشت غییرانتخابی و غیرتمایزی است: به این معنی که تقریبا همه ارگانیسم‌هایی که روی آن کشت داده شوند، رشد می‌کنند.
- حاوی نشاسته است: نشاسته شناخته شده است که سموم آزاد شده از باکتری را جذب می‌کند تا نتوانند با آنتی‌بیوتیک‌ها تداخل داشته باشند. همچنین سرعت انتشار آنتی‌بیوتیک‌ها را از طریق آگار کنترل می‌کند.
- آگاری با تراکم کم است: این امر باعث انتشار بهتر آنتی‌بیوتیک‌ها نسبت به اکثر پلیت‌های دیگر می‌شود. انتشار بهتر منجر به ایجاد ناحیه مهار دقیق‌تری می‌شود.
- از نظر تکرارپذیری بین دسته‌های تولید برای تست حساسیت قابل قبول است: یعنی نتایج تست با استفاده از دسته‌های مختلف آگار مولر هينتون تا حد زیادی مشابه است.
- میزان مهارکننده‌های سولفونامید، تری‌متوپریم و تتراسایکلین در MHA پایین است (یعنی غلظت مهارکننده‌های تیمیدین و تیمین در MHA پایین است): وجود اسید پاراآمین obenzoic (PABA) و تیمین/تیمیدین در آگار مولر هينتون به حداقل رسانده شده است، بنابراین غیرفعال شدن سولفونامیدها و تری‌متوپریم را هنگام استفاده از محیط برای تست حساسیت جدا شده‌های باکتری به این عوامل ضد میکروبی به طور قابل توجهی کاهش می‌دهد.
اصول آگار مولر هينتون (MHA)
محیط کشت آگار مولر هينتون حاوی عصاره گوشت، هیدرولیزات اسیدی کازئین، نشاسته و آگار است. عصاره گوشت و هیدرولیزات اسیدی کازئین، نیتروژن، ویتامین‌ها، کربن، اسیدهای آمینه، گوگرد و سایر مواد مغذی ضروری را تأمین می‌کنند.
نشاسته به عنوان یک کلوئید عمل کرده و برای جذب هر گونه متابولیت سمی تولید شده توسط باکتری‌ها اضافه می‌شود. تجزیه نشاسته منجر به تولید دکستروز می‌شود که به عنوان منبع انرژی عمل می‌کند. آگار عامل ژل کننده است.
سطوح مهارکننده‌های تتراسایکلین و سولفونامید، تیمیدین، تیمین، یون‌های منیزیم و کلسیم کنترل می‌شوند تا در تست حساسیت اختلال ایجاد نکنند و رشد خوبی را به همراه داشته باشند. استفاده از محیط کشت مناسب برای تست حساسیت میکروارگانیسم‌ها به سولفونامیدها و تری‌متوپریم ضروری است.
آنتاگونیسم با فعالیت سولفونامید توسط اسید پاراآمین obenzoic (PABA) و آنالوگ‌های آن نشان داده می‌شود. کاهش فعالیت تری‌متوپریم که منجر به مناطق مهار کوچکتر و کلنی‌های داخلی ناحیه مهار می‌شود، در محیط کشت نامناسب آگار مولر هينتون با سطوح بالای تیمیدین نشان داده می‌شود.
به همین دلیل، میزان PABA و تیمین/تیمیدین در آگار مولر هينتون به حداقل رسانده شده است، بنابراین غیرفعال شدن سولفونامیدها و تری‌متوپریم هنگام استفاده از این محیط برای تست حساسیت جدایه‌های باکتری به این آنتی‌بیوتیک‌ها به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد.
عناصر Gms/Litre عصاره گوشت گاو 2.0 هیدرولیز اسید کازئین 17.5 نشاسته 1.5 آگار 17.0
pH نهایی 7.3 +/- 0.1 در 25 درجه سانتیگراد.
روش تهیه آگار مولر هينتون (MHA)
-
Suspending the medium (سوسپانسیون محیط کشت):
- 38 گرم از پودر محیط کشت را در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر بریزید.
-
Dissolving the medium (حل کردن محیط کشت):
- با هم زدن مداوم حرارت دهید و به مدت یک دقیقه بجوشانید تا محیط کشت کاملا حل شود.
-
Sterilization (استریلیزاسیون):
- اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه.
- نکته: بعد از اتوکلاو اجازه دهید تا خنک شود.
-
Pouring the agar (ریختن آگار):
- آگار مولر هينتون خنک شده را روی پتری دیش‌های استریل در سطحی صاف و افقی بریزید تا عمق یکنواختی داشته باشد.
-
Cooling and storing (سرد کردن و نگهداری):
- اجازه دهید تا در دمای اتاق خنک شود.
- پلیت‌ها را در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
نتیجه روی مولر هینتون آگار (MHA)
منطقه مهار در اطراف آنتی‌بیوتیک‌ها مشاهده می‌شود
کاربردهای آگار مولر هينتون (MHA)
مهمترین کاربرد آگار مولر هينتون برای تست حساسیت به عوامل ضد میکروبی است. این محیط کشت به استاندارد اصلی برای روش کربی-بائر تبدیل شده است و عملکرد آن توسط کمیته ملی استانداردهای آزمایشگاهی بالینی (NCCLS) مشخص شده است.
از MHA همچنین می‌توان برای کشت باکتری‌های جنس نایسریا (Neisseria) استفاده کرد.
این محیط کشت در دفترچه راهنمای آنالیز باکتریولوژیک غذا و دارو (FDA) برای تست مواد غذایی و روش‌هایی که به طور معمول روی باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی اختیاری انجام می‌شود، ذکر شده است.
محدودیت‌های آگار مولر هينتون (MHA)
نتایج تست با عوامل متعددی تحت تأثیر قرار می‌گیرند: اندازه inokolum (اینوکولوم: تعداد میکروارگانیسم‌های تلقیح شده)، سرعت رشد، فرمولاسیون محیط کشت و اسیدیته (pH). برای اطمینان از نتایج قابل اعتماد، رعایت دقیق پروتکل الز ضروری است.
- تراکم inokolum: تراکم inokolum می‌تواند بر اندازه zone (ناحیه مهار) تأثیر بگذارد. inokolum زیاد ممکن است منجر به zoneهای کوچکتر شود و inokolum خیلی کم، zoneهای بزرگتری ایجاد کند.
- محدودیت رشد برای برخی باکتری‌ها: برخی باکتری‌های سخت‌گیر (Fastidious) ممکن است روی این محیط کشت رشد نکنند و نیاز به افزودن خون داشته باشند.
- عدم رشد بی‌هوازی‌های سخت‌گیر: بی‌هوازی‌های سخت‌گیر روی این محیط کشت رشد نمی‌کنند.
- محدودیت روش انتشار دیسک: روش انتشار دیسک را نباید برای بی‌هوازی‌های اجباری، ارگانیسم‌های با رشد کند و میکروارگانیسم‌های نیازمند به CO2 (کاپنوفیل) استفاده کرد. این روش برای ارگانیسم‌های اختیاری یا هوازی با رشد سریع استاندارد شده است.
- غیرفعال شدن دارو: زمان‌های طولانی انکوباسیون مورد نیاز برای باکتری‌های کند رشد ممکن است منجر به غیرفعال شدن دارو شود.
- تأثیر غلظت یون‌های دو ظرفیتی: تغییرات در غلظت یون‌های دوظرفیتی، به ویژه کلسیم و منیزیم، بر نتایج تست آمینوگلیکوزید، تتراسایکلین و کولیستین با جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا تأثیر می‌گذارد.
محیط کشت نوترینت آگار
آگار Nutrients (آگار مغذي): ترکیبات، تهیه و کاربردها
آگار Nutrients یک محیط کشت عمومی و مغذی است که برای کشت میکروب‌ها استفاده می‌شود و از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم‌های غیر سخت گیر پشتیبانی می‌کند.
آگار Nutrients به دلیل توانایی رشد انواع باکتری‌ها و قارچ‌ها و همچنین دارا بودن بسیاری از مواد مغذی مورد نیاز برای رشد باکتری‌ها محبوب است.
ترکیبات آگار Nutrients
- 0.5٪ پپتین: این ماده هضم آنزیمی پروتئین حیوانی است. پپتین منبع اصلی نیتروژن آلی برای باکتری‌های در حال رشد است.
- 0.3٪ عصاره گوشت / عصاره مخمر: این ماده حاوی مواد محلول در آب است که به رشد باکتری مانند ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها، ترکیبات نیتروژن آلی و نمک‌ها کمک می‌کند.
- 0.5٪ آگار: این ماده عامل ژل‌کننده است.
- 0.5٪ NaCl: وجود سدیم کلرید در آگار Nutrients باعث حفظ غلظت نمک در محیط مشابه سیتوپلاسم میکروارگانیسم‌ها می‌شود.
- آب مقطر: آب برای رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها ضروری است و همچنین محیطی را برای انتقال مواد مغذی مختلف فراهم می‌کند.
- PH در دمای 25 درجه سانتیگراد روی خنثی (7.4) تنظیم می‌شود.
آماده سازی آگار Nutrients
- 28 گرم پودر آگار Nutrients را در 1 لیتر آب مقطر حل کنید.
- این مخلوط را در حالی که هم می‌زنید حرارت دهید تا تمام اجزاء کاملا حل شوند.
- مخلوط حل شده را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد اتوکلاو کنید.
- پس از اتوکلاو شدن آگار Nutrients، اجازه دهید خنک شود اما سفت نشود.
- آگار Nutrients را در هر پلیت بریزید و پلیت‌ها را روی سطح استریل بگذارید تا آگار سفت شود.
- درب هر پتری دیش را تعویض کرده و پلیت‌ها را در یخچال نگهداری کنید.
کاربردهای آگار Nutrients
- اغلب برای جداسازی و خالص‌سازی کشت‌ها استفاده می‌شود.
- همچنین می‌توان از آن برای ایجاد چمن باکتریایی مورد نیاز برای تست حساسیت به آنتی‌بیوتیک استفاده کرد. در واقع، تست حساسیت به آنتی بیوتیک به طور معمول روی محیط‌هایی که به طور خاص برای این منظور ساخته شده اند انجام می‌شود.
منبع:
- https://www.intechopen.com/chapters/80333
- https://microbenotes.com/mueller-hinton-agar-mha/
- https://microbiologyinfo.com/nutrient-agar-composition-preparation-and-uses/
- https://www.micropia.nl/en/discover/microbiology/agar/
- https://www.sigmaaldrich.com/US/en/applications/microbiological-testing/microbial-culture-media-preparation
