جدیدترین مقالات:
محیط کشت آگار آگار
محیط کشت آگار آگار چیست؟ + آگار در محیط کشت
محیط کشت آگار آگار یک ماده ژلاتینی طبیعی است که از دیواره سلولی جلبکهای قرمز بهدست میآید و به عنوان پایه بیشتر محیطهای کشت میکروبی به کار میرود. آگار بهتنهایی ارزش غذایی چندانی ندارد، اما به دلیل ویژگیهای فیزیکی خود (نقطه ذوب بالا، شفافیت و عدم تجزیه توسط اغلب میکروبها) محیطی جامد و پایدار برای رشد و جداسازی میکروارگانیسمها فراهم میکند. در حقیقت آگار بهعنوان حامل یا بستر برای ترکیبات مغذی محیطهای کشت مختلف (مثل نوترینت آگار، مککانکی آگار یا مولر هینتون آگار) استفاده میشود.
جهت آشنایی بیشتر با آگار آگار میتوانید مقاله معرفی آگار آگار را نیز مطالعه کنید:
محیط کشت میکروبی آگار
محیط کشت میکروبی آگار یک محیط جامد یا نیمهجامد است که برای رشد و مطالعه میکروارگانیسمها استفاده میشود. پایه آن آگار است، یک ماده ژلاتینی استخراج شده از جلبکهای قرمز، که خود ارزش غذایی ندارد اما بهعنوان حامل مواد مغذی عمل میکند.
بسته به ترکیبات اضافهشده، این محیط میتواند عمومی (برای رشد انواع باکتریها)، انتخابی (فقط رشد گروه خاصی از میکروبها) یا تمایزدهنده (قابلیت شناسایی ویژگیهای متابولیکی باکتریها) باشد. آگار در آزمایشهای میکروبیولوژی بالینی، صنعتی و تحقیقاتی بهطور گسترده برای کشت، جداسازی و تعیین ویژگیهای میکروارگانیسمها به کار میرود.
انواع محیط کشت میکروبی
انواع محیط کشت میکروبی بر اساس کاربرد و ترکیب به چند دسته اصلی تقسیم میشوند:
1. محیطهای کشت عمومی (General Purpose Media)
- برای رشد اکثر باکتریها و قارچها مناسباند.
- معمولاً غنی از مواد مغذی پایه مانند عصاره گوشت، peptone و آگار هستند.
- مثال: نوترینت آگار (Nutrient Agar)، مولر هینتون آگار (MHA)
2. محیطهای غنیشده (Enriched Media)
- حاوی مواد مغذی اضافی برای رشد ارگانیسمهای سخترشد یا نیازمند فاکتورهای خاص هستند.
- مثال: بلاد آگار (Blood Agar)، چاکر آگار (Chocolate Agar)
3. محیطهای انتخابی (Selective Media)
- رشد گروه خاصی از باکتریها را تشویق و رشد سایر میکروبها را مهار میکنند.
- مثال: مککانکی آگار (MacConkey Agar) برای باکتریهای گرم منفی، مانیتول سالت آگار (MSA) برای استافیلوکوکها
4. محیطهای تمایزدهنده (Differential Media)
- امکان تشخیص و تمایز بین گونهها یا گروههای باکتریایی بر اساس ویژگیهای متابولیکی یا رنگی را فراهم میکنند.
- مثال: مککانکی آگار (تمایز لاکتوز مثبت و منفی)، بلاد آگار (تمایز همولیز)
5. محیطهای حداقل یا ساده (Minimal Media)
- فقط مواد ضروری برای رشد میکروبها را دارند.
- برای مطالعه متابولیسم و ژنتیک میکروبها استفاده میشوند.
- مثال: M9 Minimal Media
6. محیطهای اختصاصی (Specialty Media)
- برای رشد و آزمایش میکروبهای خاص یا انجام آزمایشات اختصاصی طراحی میشوند.
-
مثال: محیطهای برای Neisseria، Haemophilus، یا محیطهای قابل تنظیم pH برای باکتریهای اسیددوست
اصول و روش تهیه محیط کشت مولر هینتون آگار (Mueller Hinton Agar – MHA)
مولر هینتون آگار (MHA) یکی از محیطهای کشت استاندارد و پرکاربرد در میکروبیولوژی بالینی است که بیشترین استفاده آن در تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی (آنتیبیوگرام) به روش دیسک دیفیوژن کربی–بائر میباشد.
ویژگیها و کاربردها
- یک محیط کشت عمومی است که برای رشد بسیاری از باکتریهای بیماریزا مناسب میباشد.
- به دلیل ترکیب دقیق و یکنواخت، انتشار آنتیبیوتیکها در آن استاندارد و قابل اعتماد است.
- فاقد ترکیباتی است که در فعالیت آنتیبیوتیکها تداخل ایجاد کنند (مانند PABA یا مقادیر بالای کاتیونهای دوظرفیتی).
- شفاف و بیرنگ است، بنابراین نواحی عدم رشد (زون بازدارندگی) بهوضوح قابل مشاهدهاند.
ترکیب اصلی (در هر لیتر)
- Beef infusion : حدود 300 میلیگرم
- Casein hydrolysate (منبع نیتروژن و آمینواسیدها): 17.5 گرم
- نشاسته (Starch) : 1.5 گرم (برای جذب سموم باکتریایی)
- آگار : 17 گرم
- pH نهایی: 7.3 ± 0.1 در 25°C
مزایا در آزمایش آنتیبیوگرام
- نبود مهارکنندههای رشد میکروبی.
- وجود نشاسته برای جذب مواد سمی ترشحشده از باکتریها.
- یکنواختی محیط که منجر به نتایج استاندارد و قابل مقایسه میشود.
کاربردهای دیگر
- کشت عمومی بسیاری از باکتریهای مهم بالینی مانند Pseudomonas aeruginosa، Escherichia coli، Staphylococcus aureus و غیره.
- در برخی موارد با افزودن خون یا فاکتورهای رشد، برای رشد ارگانیسمهای خاصی مثل Neisseria و Haemophilus مورد استفاده قرار میگیرد.
روش تهیه مولر هینتون آگار (MHA)
- سوسپانسیون محیط کشت:
38 گرم پودر محیط کشت را در 1000 میلیلیتر آب مقطر حل کنید. - حل کردن محیط کشت:
با حرارت دادن و همزدن، محلول را بجوشانید تا کاملاً شفاف شود (حدود 1 دقیقه). - استریلیزاسیون:
محلول را در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل کنید.
→ پس از اتوکلاو اجازه دهید خنک شود. - ریختن آگار در پتری دیش:
محیط خنکشده را در پتریدیشهای استریل روی سطح صاف بریزید تا ضخامت یکنواختی ایجاد شود. - سرد کردن و نگهداری:
پلیتها را در دمای اتاق بگذارید تا ببندند، سپس در دمای 2–8 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
عناصر Gms/Litre عصاره گوشت گاو 2.0 هیدرولیز اسید کازئین 17.5 نشاسته 1.5 آگار 17.0
نتیجه روی مولر هینتون آگار (MHA)
منطقه مهار در اطراف آنتیبیوتیکها مشاهده میشود
کاربردهای آگار مولر هينتون (MHA)
مهمترین کاربرد آگار مولر هينتون برای تست حساسیت به عوامل ضد میکروبی است. این محیط کشت به استاندارد اصلی برای روش کربی-بائر تبدیل شده است و عملکرد آن توسط کمیته ملی استانداردهای آزمایشگاهی بالینی (NCCLS) مشخص شده است.
از MHA همچنین میتوان برای کشت باکتریهای جنس نایسریا (Neisseria) استفاده کرد.
این محیط کشت در دفترچه راهنمای آنالیز باکتریولوژیک غذا و دارو (FDA) برای تست مواد غذایی و روشهایی که به طور معمول روی باکتریهای هوازی و بیهوازی اختیاری انجام میشود، ذکر شده است.
محدودیتهای آگار مولر هينتون (MHA)
نتایج تست با عوامل متعددی تحت تأثیر قرار میگیرند: اندازه inokolum (اینوکولوم: تعداد میکروارگانیسمهای تلقیح شده)، سرعت رشد، فرمولاسیون محیط کشت و اسیدیته (pH). برای اطمینان از نتایج قابل اعتماد، رعایت دقیق پروتکل الز ضروری است.
- تراکم inokolum: تراکم inokolum میتواند بر اندازه zone (ناحیه مهار) تأثیر بگذارد. inokolum زیاد ممکن است منجر به zoneهای کوچکتر شود و inokolum خیلی کم، zoneهای بزرگتری ایجاد کند.
- محدودیت رشد برای برخی باکتریها: برخی باکتریهای سختگیر (Fastidious) ممکن است روی این محیط کشت رشد نکنند و نیاز به افزودن خون داشته باشند.
- عدم رشد بیهوازیهای سختگیر: بیهوازیهای سختگیر روی این محیط کشت رشد نمیکنند.
- محدودیت روش انتشار دیسک: روش انتشار دیسک را نباید برای بیهوازیهای اجباری، ارگانیسمهای با رشد کند و میکروارگانیسمهای نیازمند به CO2 (کاپنوفیل) استفاده کرد. این روش برای ارگانیسمهای اختیاری یا هوازی با رشد سریع استاندارد شده است.
- غیرفعال شدن دارو: زمانهای طولانی انکوباسیون مورد نیاز برای باکتریهای کند رشد ممکن است منجر به غیرفعال شدن دارو شود.
- تأثیر غلظت یونهای دو ظرفیتی: تغییرات در غلظت یونهای دوظرفیتی، به ویژه کلسیم و منیزیم، بر نتایج تست آمینوگلیکوزید، تتراسایکلین و کولیستین با جدایههای سودوموناس آئروژینوزا تأثیر میگذارد.
محیط کشت نوترینت آگار
آگار Nutrients (آگار مغذي): ترکیبات، تهیه و کاربردها
آگار Nutrients یک محیط کشت عمومی و مغذی است که برای کشت میکروبها استفاده میشود و از رشد طیف وسیعی از ارگانیسمهای غیر سخت گیر پشتیبانی میکند.
آگار Nutrients به دلیل توانایی رشد انواع باکتریها و قارچها و همچنین دارا بودن بسیاری از مواد مغذی مورد نیاز برای رشد باکتریها محبوب است.
ترکیبات آگار Nutrients
- 0.5٪ پپتین: این ماده هضم آنزیمی پروتئین حیوانی است. پپتین منبع اصلی نیتروژن آلی برای باکتریهای در حال رشد است.
- 0.3٪ عصاره گوشت / عصاره مخمر: این ماده حاوی مواد محلول در آب است که به رشد باکتری مانند ویتامینها، کربوهیدراتها، ترکیبات نیتروژن آلی و نمکها کمک میکند.
- 0.5٪ آگار: این ماده عامل ژلکننده است.
- 0.5٪ NaCl: وجود سدیم کلرید در آگار Nutrients باعث حفظ غلظت نمک در محیط مشابه سیتوپلاسم میکروارگانیسمها میشود.
- آب مقطر: آب برای رشد و تکثیر میکروارگانیسمها ضروری است و همچنین محیطی را برای انتقال مواد مغذی مختلف فراهم میکند.
- PH در دمای 25 درجه سانتیگراد روی خنثی (7.4) تنظیم میشود.
آماده سازی آگار Nutrients (طرز تهیه محیط کشت نوترینت آگار)
- 28 گرم پودر آگار Nutrients را در 1 لیتر آب مقطر حل کنید.
- این مخلوط را در حالی که هم میزنید حرارت دهید تا تمام اجزاء کاملا حل شوند.
- مخلوط حل شده را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد اتوکلاو کنید.
- پس از اتوکلاو شدن آگار Nutrients، اجازه دهید خنک شود اما سفت نشود.
- آگار Nutrients را در هر پلیت بریزید و پلیتها را روی سطح استریل بگذارید تا آگار سفت شود.
- درب هر پتری دیش را تعویض کرده و پلیتها را در یخچال نگهداری کنید.
کاربردهای آگار Nutrients
- اغلب برای جداسازی و خالصسازی کشتها استفاده میشود.
- همچنین میتوان از آن برای ایجاد چمن باکتریایی مورد نیاز برای تست حساسیت به آنتیبیوتیک استفاده کرد. در واقع، تست حساسیت به آنتی بیوتیک به طور معمول روی محیطهایی که به طور خاص برای این منظور ساخته شده اند انجام میشود.
جایگزین آگار در محیط کشت
در سال 1986، کاراگینان به عنوان جایگزینی برای آگار عامل ژل کننده در کشت بافت گیاهی استفاده شد. با توجه به نتایج بهدستآمده در تحقیق، رشد بافتها روی این ژل بهتر از زمانی بود که محیط با آگار جامد شد.
در کوبا، مرکز تحقیق و توسعه داروها (CIDEM) استفاده از آلوئه ورا (Aloe barbadensis miller) و آرد ساگو (Maranta arundinacea) را به عنوان پشتیبان جامد در محیط های کشت گیاهان دارویی مورد بررسی قرار داد.
این تحقیق نشان داد که جایگزینی جزئی یا کامل آگار با ژل A. vera یا آرد ساگو امکان پذیر است. علاوه بر این، از این محیط کشت برای تکثیر در شرایط آزمایشگاهی آگراز (Vaccinium meridionale Swartz) استفاده شده است.
در سال ۲۰۱۲، مطالعهای در اتیوپی بر روی کارایی نشاسته انست (بولا) به عنوان یک عامل ژلکننده انجام شد که به طور قابل توجهی تعداد جوانهها را بهبود بخشید و حدود ۷۲.۵ درصد در هزینهها صرفهجویی کرد.
در مطالعه دیگری، جایگزینی بخشی از آگار با نشاسته رقم دیاکول کاپیرو در تکثیر میکرو علفه لولو سولانوم کیتوئنسه لام انجام شد که نتیجه مثبتی داشت.
چشماندازهای آینده در توسعه این فناوری زیستی به سمت جایگزینی قسمتی یا کامل آگار به عنوان عامل ژل کننده با عوامل ژلکنندهای است که به طور مؤثرتر، آسان تر قابل استخراج، محلی تهیه شوند و موقتی نباشند. علاوه بر بهبود تولید گیاه در فضاهای کوچک و منابع حاصل برای مقابله با چالش های آینده تکثیر میکروبی بدون خطر آلودگی محصول.
منابع:
- https://www.intechopen.com/chapters/80333
- https://microbenotes.com/mueller-hinton-agar-mha/
- https://microbiologyinfo.com/nutrient-agar-composition-preparation-and-uses/
- https://www.micropia.nl/en/discover/microbiology/agar/
- https://www.sigmaaldrich.com/US/en/applications/microbiological-testing/microbial-culture-media-preparation
